编者导语

首先，非常荣幸的邀请到袁超博士做客“临床质谱网媒体平台”。为了答谢业内同行的厚爱，我们将会在“专家讲坛”栏目中持续发布袁老师有关临床质谱的应用、标准品、线性、权重、同位素内标、离子抑制、基质效应等精彩干货内容，以飨读者。承接上期，本期袁老师为大家带来标准曲线中权重的精彩介绍。

作者简介

袁超博士

现任美国华人临床化学学会主席，美国大型临床检测实验室质谱实验室主任。于四川大学获得生物化学学士学位、美国堪萨斯大学获得生物化学博士学位，其后在霍普金斯和伊利诺伊大学做博士后，主要研究方向为蛋白质组和质谱。袁超博士最近十年主要从事临床质谱方法开发和应用。

第五节 妥协的艺术-权重

理想的情况下，所有标准品的点都在一条直线上。但现实情况往往不会这么完美。就像要修一条高铁，靠近了这个城市，就可能疏远了那个城市。每个点都想高铁从我这里过。怎么取舍，怎样选择，这就是妥协的艺术。

既然不能满足所有人，那就把大家的不满足的总和做到最小就行了。对于标准曲线来说，这个方法就叫线性回归（linear regression，点到线的垂直距离)。实际生活中用的更多的是Deming Regression（点到线的直线距离）。如果你对X的测量很有信心，那就用前者；如果X和Y的测量都没有百分百的把握，就用后者。

目前为止，我们对每个点都是一视同仁的。好比公司食堂每周的菜谱，每个人都有投票权，这叫民主。但是公司业务上的决定就不能这样了。明年上马什么项目是不会过问保安和保洁的。这时候领导的意见就占上风了，所谓"位高权重"和"人微言轻"。在标准曲线上，这个还真翻译成了权重（weighing factor）。常见的权重是1/X。就好比投票的时候，你的票要乘以一个系数，这个系数可以是你的工资，也可以是你管理的人的数目。这样领导的权重就显出来了。反应在政治生活里，就是社会的精英阶层决定社会的走向。在临床检测中，这样做也是有意义的。比如你的曲线是从浓度1个单位到100个单位。那么1个单位的偏差对于1来说就是50%，但对于100来说就只有1%。所以划线的时候当然要照顾浓度低的点，上面的点偏个十个八个单位，也关系不大。1/X权重的意思就是每个点到线的距离要乘以1/X、再加和、然后取最小值。如果总统选举也可以加权重（选票乘以你过去四年交的联邦税），那些靠吃救济吃饭不交税的穷人就没有发言权了，民主党也就没戏了。所以政治是最能体现妥协的活动。参政两院的体制就是个典型。每个州有两名参议员的名额，众议员的人数则按你本州的人数多寡决定。一个加权，一个不加权。重大事项必须在参众两院都通过才行。这样既照顾了小州，又照顾了大州，这就是妥协。现在人人都有投票权，200年前黑奴是没有投票权。有一阵儿，一个黑人有3/5张选票。这也是南方州和北方州的妥协。因为如果不妥协，那就是战争。与其战争，还不如妥协。

另一个常见的权重就是1/X2。这样的话每张选票就不是乘以所得税了，而是乘以所得税的平方。这样富人就有更大的决定权了。在政治生活里，这个叫寡头，国家的命运决定在少数人手里。最极端的情况是由一个点来决定曲线的走向，这个叫独裁。1/X2权重反应在标准曲线上，就是低浓度的点更有决定性。这个在临床检测上是有意义的。大多数的指标都是低的是好，高的不健康。标准曲线的范围往往涵盖了正常人和病人的常见值。而正常人往往在这个范围的低端。临床检测最重要的是能把高的正常的值和低的病人的值分开，至于很高的值，测的准不准已经不重要了。好比空腹葡萄糖的100 mg/dL和125 mg/dL有很大区别，一个是正常、一个是糖尿病；但200和250就没有临床意义了。

1/X和1/X2，哪一个更好呢？这是一个困扰了我很久的问题。以前选1/X2是理所当然的，因为有专门的文章论述讲1/X2为什么更好。我也就从来没有试过1/X的权重。换了单位以后，发现标准曲线的权重基本上都是1/X。人越老，越没有志气。改造世界的勇气越来越小，改变自己适应环境的能力越来越强。单位这么大，牛人这么多，用1/X肯定有道理。收起自己的疑问，慢慢观察。发现除了权重，还有好多跟以前不一样的地方。这些不同渐渐开始发生了关联，变得有道理起来，最后帮助自己从不同的角度来认识这个行业，这个社会。

1/X2是建立在低浓度能测的很准的基础上了。你给了低浓度那么大的权重，如果测不准，那影响岂不是太大。怎样知道低浓度是不是测的准呢？答案要从实践中得来。把所有浓度的标准品测十次，算平均值和方差，再算CV。如果CV从高浓度到低浓度都在5%以内，那低浓度给个1/X2的权重是可以的。但如果高浓度的CV不错，但低浓度的CV接近10%了，那低浓度就不能给它1/X2的权重了。好比拍脑门一天一个主意的领导的话，不能太当回事。即便低浓度的CV在5%以内，我的建议还是用1/X。这个5%是在一天内取得的。如果不同的人在不同的日子里做，就不一定能达到了。如果真能达到，那你的方法就是好的过头了，需要把它人为的降一降，以节省成本。比如用的量变小一些，本来用200微升血样的，试试100微升；本来进样80微升的，试试40微升。进的样品量少，对仪器的污染就小，仪器使用的时间就更长；另外残留也会少，可以减少重复率。最终的目的都是降低成本。

低浓度的重复性差是允许的。CLSI里就有这样的论述。标准品的测得值和规定值之间的差别可以在低浓度时放开一些，别的点是15%，最低的点可以是20%。由于低浓度的点测的不是很稳定，所以不能给1/X2的权重，1/X是恰如其分的。为什么？有几个原因。1）医院是不会把整管血给公司的；它自己要留一些做其它检测项目。所以我们拿到的样品的体积要比医院小。不是每个样品都少。但是我们的方法要尽量照顾体积小的样品（又是权重），所以同样的检测方法，我们用的样品量要少。量少，这就会影响灵敏度，尤其是低端的灵敏度；2）公司的仪器更老，灵敏度更低。一般仪器的寿命是7年。医院财大气粗，买新仪器不眨眼睛。公司里超过10年的老仪器比比皆是。3）公司的标准曲线范围更宽，一般都到99%了。宽的好处是涵盖的范围大，超出这个范围的样品就会很少。所以公司用的标准曲线上的低浓度更低，高浓度更高。这可以减少样品的重复率（超出线性范围的样品，需要稀释后再测），最终目的是减少成本。总之一句话，公司里要用更差的仪器，更少的样品，把更低的浓度测出来。听起来好像很困难。但也不是做不到。具体的方法有很多，不是都能说的。1/X是能说的一个。用了1/X，我们就不倚重最低的点了，中浓度的点还是测的准，靠的住的。公司里样品量巨大，所以标准品可以用好几个浓度的。医院的量少。一天就20个样品，放上11个标准品就显得头大身子小了。一般都是5个点，所以每个点都重要。两点总是一条直线；三个点谁也说服不了另外两个；四个点可以两两作对；只有到了五个点，才能做到民主，协商，妥协，共赢。公司里每天成百上千的量，放11个点做曲线不在话下。在这11个点中，最被看重的是中间的7 个点。这七个点是中流砥柱。他们基本决定了标准曲线的走向。但凡有一个反骨，直接去掉就行了。这样画出来的曲线，延伸到低端也能保证是基本正确的。更何况公司的曲线低端已经低到没有临床意义了，放在那儿就是个摆设。最是摆设的应该是浓度为零的那个点。正常情况下是用不上的。如果它有读数了，那说明某种溶液被污染了。这个点好比总统的替身；他没事儿，就没他的事儿；他有事儿，那就是出大事儿了。

从上可以看出商业和医院实验室的区别。商业实验室是追求效率和效益的：在满足质量的前提下，怎么省钱怎么做；医院是直接服务临床的：精益求精，没有最好，只有更好，关键是让医生高兴。有时候好到过分的地步了。好比是跳高比赛，公司的目的是只要能过杆儿就行，再高就是浪费体力；医院是要做到比别人更高、更快、更强。如果50以下都是正常，公司就会觉得能把10和15区分开是就一种浪费。好比一个子弹打死一个敌人是好，三个子弹打死一个敌人就是浪费。我天天琢磨的就是怎么能一个子弹打死仨敌人。

说到权重，那就把另外几个跟标准曲线相关的参数也讨论一下吧。首先是过不过原点。一般情况下是不过的。过的话，低浓度点的偏差会太大。其中一个原因是本底。没有任何物质的浓度会绝对是零的。比如尼古丁，只要你的方法够灵敏，它是无处不在的。有了本底，标准曲线就无法过零点，强制过零点是会出麻烦的。

特殊情况下是可以过原点的，比如只有一个标准品的时候。这个标准品和原点连一条线就是标准曲线。这样做在质谱里非常少见，但在纯色谱方法里倒是很常见。我觉得原因有四。其一是色谱法多是很多年前建的老方法。那时候没这么多讲究，怎么简单怎么来。其二是老方法都很长，20-30分钟的很常见。这样的话标准品多了，样品做到下班也做不完，对服务临床不利。第三，光吸收做定量的线性非常好，不管是向下延伸还是向上延伸，因为它不像质谱，有离子化这么个不太有重复性的步骤。第四个就是色谱方法特有的，叫归零，这个在质谱上做不到。就好像打算盘，会的都是老人家，年轻人都不会。归零就是在检测方法的最开始强制的把那个时候的光吸收值定为零。这样的话，即便有本底，也都给归零、看不出了。目前为止，还没有哪一家的质谱生产商能做出自动归零的软件。一个标准品加上原点，那就没有权重什么事儿了，因为怎么画都是两点一线。自动归零延伸出另外一个更神奇的东西，那就是流动相可以循环使用！每天不用配流动相了。流动相从柱子流出去，经过光吸收的检测池，又流回到了装流动相的瓶子里！我第一次看到的时候简直不敢相信自己的眼睛，这个老古董的方法真的好有创意啊！因为有自动归零，所以流动相被污染了也可以用。另外，色谱法很多是等梯度洗脱的，只有一瓶流动相，所以可以重复使用，唯一不好的是方法的时间太长。第三，老方法的样品前处理很复杂，处理完的样品非常干净，不会有太大污染。现在的色谱仪更先进了，可以把出峰的那一段儿分到废液里，其它相对干净的还是流回到原瓶，这样样品就不用处理的那么干净，或者流动相重复使用的次数更多一些。

还有一个有意思的话题是标准曲线到底是直线还是曲线。顾名思义，应该是条曲线，可偏偏大部分情况下，它是条直线。有没有弯的标准曲线呢？有。

质谱的线性范围一般在3.5个数量级左右，也就是说最高和最低大概差个几千倍。这个在临床上够用了，很少有那个被测物在不同人的体内能差一万倍的。但是，凡事都有例外。一是人为的没经验，为了追求灵敏度，样品用的量太大，超出了质谱的线性范围，在高浓度的时候，浓度还在往上走，但是质谱仪的信号饱和了。电喷雾的时候，没有再多的离子可以给你了，浓度再高，信号也上不去了，这时候的标准曲线就要弯了，向下弯。还有更甚之的是连色谱都饱和了，出的峰不但高，而且头是平的，还有fronting。第二种情况比较特殊，是离子化的协同效应，也就是1加1要大于二。在被测物的浓度升高的时候，离子化有叠加的效应。这样浓度升高时，标准曲线也会弯，但是是反方向的弯，向上弯。还有一种解释是吸附作用。浓度低的时候，被测物被容器吸附了。浓度增高时，被吸附的相对减少，信号增加的比浓度更快，所以向上弯了。第三种情况是有多个被测物存在的情况下，为了照顾那个信号最低的，把信号高的被测物顶到质谱的线性范围以外了。这个时候的解决办法就是要人为的降一降那个信号好的，比如用个丰度低的离子，或者把Q2的碰撞能量加一加，等等。最终目的是让大家齐头并进，都控制在质谱的线性范围内，因为标准曲线还是直的好。

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